Секвенирование будущего: PacBio против Oxford Nanopore ‒ битва титанов третьего поколения

Мир геномики развивается с головокружительной скоростью. Еще вчера секвенирование целого генома человека казалось научной фантастикой, а сегодня это рутинная процедура. И во многом этот прогресс обусловлен появлением технологий секвенирования третьего поколения, которые совершили настоящую революцию в генетических исследованиях. Мы, как энтузиасты и практикующие исследователи, не могли остаться в стороне и решили поделиться своими наблюдениями и опытом работы с двумя лидерами этой области: PacBio и Oxford Nanopore.

В этой статье мы подробно рассмотрим эти два метода, сравним их сильные и слабые стороны, а также расскажем о нашем опыте их применения в различных проектах. Приготовьтесь к захватывающему путешествию в мир длинных прочтений, эпигенетики и революционных открытий!

Что такое секвенирование третьего поколения?

Чтобы понять, чем так хороши PacBio и Oxford Nanopore, нужно немного разобраться в истории секвенирования. Первое поколение технологий, основанное на методе Сэнгера, было трудоемким и дорогим. Второе поколение, или NGS (Next Generation Sequencing), значительно ускорило процесс и снизило стоимость, но столкнулось с проблемой коротких прочтений. Эти короткие фрагменты ДНК, хотя и получались в огромных количествах, было сложно собрать вместе, особенно в сложных участках генома, содержащих повторы или структурные вариации.

И вот тут на сцену выходят технологии третьего поколения! Их главное преимущество – возможность получать очень длинные прочтения, иногда достигающие десятков или даже сотен тысяч пар оснований. Это позволяет с легкостью разрешать сложные участки генома, обнаруживать структурные вариации и проводить полногеномное секвенирование de novo с гораздо большей точностью и полнотой.

Основные преимущества секвенирования третьего поколения:

• Длинные прочтения: Гораздо проще собирать геном и выявлять структурные вариации.
• Прямое обнаружение модификаций ДНК: Некоторые платформы позволяют выявлять метилирование и другие эпигенетические метки без дополнительных этапов обработки.
• Секвенирование РНК: Возможность секвенирования полноразмерных молекул РНК, что важно для изучения транскриптомов;

PacBio: точность и консенсус

Pacific Biosciences (PacBio) использует технологию секвенирования единичной молекулы в реальном времени (Single Molecule, Real-Time – SMRT). В основе этого метода лежит наблюдение за тем, как ДНК-полимераза встраивает меченые нуклеотиды в растущую цепь ДНК. Каждый нуклеотид имеет свою флуоресцентную метку, и когда он встраивается, излучается свет, который регистрируется детектором. Это позволяет в реальном времени определять последовательность ДНК.

Одной из ключевых особенностей PacBio является циркулярный консенсус секвенирование (Circular Consensus Sequencing – CCS). Молекула ДНК циркуляризуется, и полимераза многократно считывает ее, что позволяет получить очень точную консенсусную последовательность. Хотя отдельные прочтения могут содержать ошибки, многократное считывание позволяет их исправить.

Преимущества PacBio:

• Высокая точность консенсусной последовательности: Благодаря CCS.
• Возможность обнаружения модификаций ДНК: PacBio позволяет выявлять метилирование оснований.
• Длинные прочтения: Обычно несколько тысяч пар оснований, но могут достигать и десятков тысяч.

Недостатки PacBio:

• Относительно низкая пропускная способность: По сравнению с NGS.
• Более высокая стоимость на один прогон: Хотя стоимость на одно прочтение может быть конкурентоспособной.
• Подготовка образцов: Может быть более сложной по сравнению с Oxford Nanopore.

Oxford Nanopore: секвенирование через нанопоры

Oxford Nanopore Technologies (ONT) использует принципиально иной подход. В основе метода лежит прохождение молекулы ДНК через белковую нанопору, встроенную в мембрану. Когда ДНК проходит через пору, она изменяет ионный ток, протекающий через нее. Каждое основание ДНК (A, T, G, C) оказывает различное влияние на ток, что позволяет идентифицировать его.

Главное преимущество Oxford Nanopore – возможность получения ультрадлинных прочтений. Теоретически, длина прочтения ограничена только длиной молекулы ДНК. На практике, прочтения часто достигают сотен тысяч или даже миллионов пар оснований!

Преимущества Oxford Nanopore:

• Ультрадлинные прочтения: Позволяют разрешать самые сложные участки генома.
• Низкая стоимость оборудования: MinION – портативное и относительно недорогое устройство.
• Секвенирование в реальном времени: Данные доступны практически сразу.
• Простота подготовки образцов: Относительно простая и быстрая процедура.
• Портативность: MinION позволяет проводить секвенирование в полевых условиях.

Недостатки Oxford Nanopore:

• Более высокая частота ошибок: По сравнению с PacBio и NGS.
• Требования к качеству ДНК: Длинные молекулы ДНК могут быть повреждены в процессе подготовки.
• Чувствительность к загрязнениям: Примеси могут влиять на качество данных.

Сравнение PacBio и Oxford Nanopore: таблица

Чтобы наглядно сравнить эти две технологии, мы подготовили таблицу, в которой собрали основные характеристики:

Характеристика	PacBio	Oxford Nanopore
Длина прочтения	Средняя: 10-20 тыс. п.о., Максимальная: > 50 тыс. п.о.	Средняя: 10-50 тыс. п.о., Максимальная: > 1 млн п.о.
Точность (консенсус)	> 99.999% (HiFi)	90-98% (зависит от модели и прогона)
Пропускная способность	Относительно низкая	Средняя
Стоимость	Выше на один прогон	Ниже на один прогон
Обнаружение модификаций ДНК	Да (метилирование)	Да (метилирование, другие модификации)
Подготовка образцов	Более сложная	Более простая
Портативность	Нет	Да (MinION)
Применение	Сборка геномов de novo, выявление изоформ, эпигенетика	Сборка геномов de novo, выявление структурных вариаций, мониторинг патогенов, секвенирование в полевых условиях

Наш опыт работы с PacBio и Oxford Nanopore

В нашей лаборатории мы активно используем обе технологии для различных проектов. PacBio отлично подходит для сборки геномов бактерий de novo, особенно когда требуется высокая точность. Мы также используем PacBio для изучения изоформ генов и анализа метилирования ДНК.

Oxford Nanopore стал незаменимым инструментом для выявления крупных структурных вариаций в геномах человека. Ультрадлинные прочтения позволяют нам с легкостью обнаруживать делеции, дупликации и инверсии, которые сложно выявить с помощью NGS. Кроме того, мы активно используем MinION для мониторинга патогенов в образцах окружающей среды.

Например, в одном из проектов мы использовали Oxford Nanopore для секвенирования генома гриба, вызывающего заболевание растений. Ультрадлинные прочтения позволили нам собрать геном de novo с минимальным количеством пробелов и выявить гены, отвечающие за вирулентность. Это позволило нам разработать новые стратегии борьбы с этим патогеном.

Выбор метода: что лучше для ваших задач?

Выбор между PacBio и Oxford Nanopore зависит от конкретной задачи. Если вам нужна высокая точность консенсусной последовательности и важна возможность обнаружения модификаций ДНК, то PacBio – отличный выбор. Если же вам нужны ультрадлинные прочтения для разрешения сложных участков генома, или вы хотите проводить секвенирование в полевых условиях, то Oxford Nanopore – более подходящий вариант.

В идеале, комбинация обеих технологий может дать наилучшие результаты. Например, можно использовать Oxford Nanopore для получения длинных прочтений и PacBio для полировки консенсусной последовательности.

Будущее секвенирования третьего поколения

Технологии секвенирования третьего поколения продолжают развиваться с огромной скоростью. Появляются новые платформы, улучшается точность и пропускная способность, снижается стоимость. Мы уверены, что в ближайшем будущем эти технологии станут еще более доступными и широко используемыми, что приведет к новым прорывным открытиям в геномике, медицине и других областях науки.

Мы с нетерпением ждем новых достижений в этой области и надеемся, что наша статья помогла вам лучше понять возможности и перспективы секвенирования третьего поколения.

Подробнее

LSI Запрос	LSI Запрос	LSI Запрос	LSI Запрос	LSI Запрос
Сравнение технологий секвенирования	PacBio точность секвенирования	Oxford Nanopore длина прочтения	Секвенирование генома человека	Метод секвенирования SMRT
Нанопоровое секвенирование ДНК	Секвенирование третьего поколения применение	Анализ метилирования PacBio	Сборка генома de novo	MinION портативный секвенатор